RNA提取过程中有哪些关键步骤及注意事项

问题描述

精选答案

细胞中的RNA主要有三类：rRNA约占80％－85％，tRNA和核内小分子RNA约占10%-15%，mRNA约占1%-5%，由于rRNA占绝大多数，因此我们用琼脂糖凝胶电泳可以看到的即是rRNA，它也有三种类型：28S，18S，5S。所以我们看到的也应该是三条带，而且28S的亮度为18S的两倍。这样的RNA才可以用来建库。在RNA的提取时，一定要注意RNase的污染，因RNA极易被RNase的降解，操作时应尽量少说话，并在洁净的环境中操作，主要防止手、唾液和空气中Rnase的污染；另一方面使用的所有玻璃仪器、移液器、吸头和离心管都用0.5%DEPC溶液处理过夜,然后高压灭菌15分钟.但对于灭菌的一次性使用的塑料制品基本上无RNase,，可以不经处理直接用于提取RNA，实验室用的普通玻璃器皿和塑料制品经常有Rnase污染，使用前必须180度干烤8小时或更长时间（玻璃器皿）或用氯仿冲洗（塑料制品），另外，由于材料不同，机体内含有的糖、酚类物质不一样，因此材料不同用的方法也应该不一样。下面是两种提取方法，第一种适用于嫩组织或动物组织的总RNA的提取，第二种适用于老组织的提取。试剂：提取缓冲液，KAc(5M), 异丙醇，无水乙醇，DEPC水仪器：离心机，恒温水浴锅，研钵方法一 动物、植物（嫩叶）的总RNA分离大约2克植物组织或动物组织用液氮研磨↓加5mlTrizol裂解液 ↓12000rpm ，4度，10分钟 ↓加入1ml氯仿 ↓剧烈振荡15秒，室温温育2-3分钟↓室温离心10分钟，8000rpm↓取上清，加入等体积的异丙醇，15-30度放置10分钟。↓12000g离心10分钟 ↓弃上清，加入10ml75%洒精洗沉淀。 ↓2-8度下，不超过7500g离心5分钟 ↓弃上清，干燥沉淀10分钟↓用DEPC水溶。方法二 、植物老叶、老根或多糖含量高的材料的总RNA分离 1g组织液氮研磨，加入6ML提取缓冲液↓2min振荡↓65℃，20min↓加入1.5MLKAc↓混匀，冰浴20min↓8000rpm,4℃,15min取上清，加入0.6倍异丙醇，-20℃，1小时（或室温15-20min）↓12000rpm,4℃,15min↓75%乙醇，12000rpm,20℃,5min↓晾干，溶60ulDEPC水，15min↓ 12000rpm,4℃,5min, 上清即为RNA。