DNA跑完胶后为什么要进行纯化PCR后的DNA

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精选答案

谢邀。高保真的酶是不能够用来PCR后直接去连接TA克隆的，必须用TAQ加A尾纯化后才能连接.给你个做的方法，首先PCR扩增目的片段，可以配两个40ul的体系，PCR循环可以增加到35个循环，这样可以保证PCR产物量多，而且保真性也好。

然后跑胶，胶回收，胶回收溶解DNA的时候，尽量用比较大的体积的水溶解下来，这样可以保证尽可能量大的获得PCR产物，然后去加A尾，加A尾的时候，使用ATP和dATP都可以，但是ATP跟dATP不可浓度太高，太高浓度的dATP会抑制taq酶的活性，taq酶加的时候要控制在总体积的百分之十以内，加A尾一般是72度，30min.l,自己做的时候可以适当延长时间。

加A尾完成后，胶回收，尽量用少的水来溶解DNA,这个时候要保证DNA的浓度尽可能的高。

连接的时候，如果片段浓度高的话，片段又不太长，我习惯连1h,转化挑克隆基本效率能有百分之百，如果片段浓度低，长度又长，可以适当延长连接时间。

TA克隆载体大小相对来小，装载片段的长度是有限的，片段长度如果比载体还大，效率就会降低，这时候尽量要多PCR,延长连接时间，这样子可以提高效率的。

再补一段，鉴定的时候可以先把细菌挑到96孔板，细菌摇起来以后去PCR鉴定，Takara 的PMD19T里应该有说明书的，里面应该有设计好的引物。