PCR过程中模板加多了有什么影响

问题描述

精选答案

模板多加，最大的影响就是DpnI消解模板的时候容易消解不完全，这个可以从阴性对照的平板上涨了多少菌落看出来，（阴性对照就是可实验组加同样多的模板，以及buffer和酶等等，只是不加引物，最好一起PCR，一起Dpn I消解，一起转化）。

最佳的肯定是阴性的板子一个都没长，也就说明你实验组的板子上长出来的全部是突变成功的，如果消解不完全，就看阴性的平板上菌落多不多(模板是超螺旋质粒，突变的质粒是带缺刻的，转化效率不及超螺旋状态的质粒)，要是相比你实验组板子上菌落数微不足道，那也没关系，挑两个去测序，运气没那么背。

现在你是模板多加了一点，那其实完全可以在后续的步骤中补救；比如你做了25μl体系的突变PCR，那么除去取5-10μl跑个电泳确认突变引物P成功了，剩下的15μl你可以少取点(比如5μl)进行DpnI消解，并且可以增加DpnI酶的用量和反应时间，这些都可以增加完全消解模板的几率。