基因组分离纯化有哪些

问题描述

精选答案

纯化DNA的常用方法是用酚抽提-乙醇沉淀法，适用于普通实验室操作。它通过交替使用苯酚、氯仿两种不同的蛋白质变性剂，可以增加去除蛋白质杂质的效果；氯仿可以去除核酸溶液中的微量酚，还可以加快有机相与液相混合，去除色素和蔗糖；在氯仿中加入少量的异戊醇可以减少蛋白质变性操作过程中产生的气泡。

【实验材料】

待纯化的DNA溶液。

【实验仪器】

高压灭菌锅，涡旋混匀器，台式高速冷冻离心机

【试剂配制】

1、Tris饱和酚（pH8.0）：氯仿：异戊醇混合液

酚：氯仿：异戊醇按体积比25：24：1配制，现配现用。

2、氯仿：异戊醇混合液

氯仿：异戊醇按体积比24：1配制，现配现用。

3、醋酸钠溶液

配制3 mol／L的醋酸钠溶液，调节pH值至5.2。

4、TE缓冲液

10 mmol／L Tris·HCl（pH 8.0），1 mmol／LEDTA（pH 8.0），配制完成后高压灭菌，4 ℃保存。

【实验步骤】

1、在待纯化的DNA溶液中加等体积的酚：氯仿：异戊醇混合液，然后在涡旋混匀器上充分混匀。

2、将混合物12000 r／min离心10 min后，移取上层含DNA的水相到另一离心管中。如果在水相和有机相交界处有白色沉淀物，则需要重新抽提水相，直到两相交界处无明显沉淀物。

3、向上层水相中加入等体积的氯仿：异戊醇（24：1）混合液，在涡旋混匀器上充分混匀后12000 r／min离心10 min。

4、移取上层含DNA的水相到另一离心管中，加1／10体积的醋酸钠溶液，充分混匀，再向管中加入2.5倍体积的预冷无水乙醇，上下倒置混匀，于-20 ℃保存30 min。

5、12000 r/min离心5 min，弃上清液；75%的乙醇12000 r/min离心洗涤5 min，弃上清液；用吸头将管壁残留的乙醇去除，室温干燥10-15 min（不要等DNA沉淀完全干燥，否则DNA不易溶解）。

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6、在盛有干燥DNA的离心管中加入适量TE缓冲液，溶解后在-20 ℃以下长期保存。