定点突变是怎么通过PCR作用达到目的的

问题描述

精选答案

定点突变是准备多个带突变的引物，退火后全部突变引物都结合在同一环状单链模版，PfuTurbo聚合酶延伸，碰到下一个引物就停止，各片断经连接成环，和单链模版组成杂和环，DpnI消化双链模版，也消化杂和环中的模版，只留下新合成的带多个突变的单链环，得以转化E.coli，形成双链质粒。

具体来讲是：设计一对包含突变位点的引物（正、反向），和模版质粒退火后用PfuTurbo聚合酶“循环延伸”，(所谓的循环延伸是指聚合酶按照模版延伸引物，一圈后回到引物5’端终止，再经过反复加热褪火延伸的循环，这个反应区别于滚环扩增)正反向引物的延伸产物退火后配对成为带缺刻的开环质粒。

DpnI酶切延伸产物，由于原来的模版质粒来源于常规大肠杆菌，是经dam甲基化修饰的，对DpnI敏感而被切碎（DpnI识别序列为甲基化的GATC，GATC在几乎各种质粒中都会出现，而且不止一次）、而体外合成的带突变序列的质粒由于没有甲基化而不被切开，因此在随后的转化中得以成功转化，即可得到突变质粒的克隆。扩展资料不同于定点突变的是基于PCR的随机突变，通过改变PCR条件提高PCR过程中的随机出错，这种方法适用于未知的蛋白质，作全局性分析，所以有人称为饱和突变（saturation mutagenesis）。

不过这种方法由于没有目的性，分析操作相当繁琐，并且不会出现一个位点2个以上碱基突变，因而应用上有局限性。

定点突变适用于蛋白结构已有初步了解的基因，比PCR随机突变更有目的性，也更为精确，简单。根据生物学理论知识，基因会发生突变，突变可以自发，也可以诱发。

但在加拿大生物化学家M·史密斯（1932－2000年）发明定点突变法之前，突变株的产生必须经由自然界或用化学等方法诱使基因体突变。

这类方法属于随机突变，突变株必须在生物形状上有所改变，才能确定有突变发生，但除非用分子生物方法或遗传方法找到此突变处，否则无法确定突变位置。

也就是说，这种突变是盲目的。

而史密斯发明的定点突变法却是有目的的，该法可经由设计好的寡核苷酸，在任何一个基因片段上进行随意或设计好的突变，也就是说，这种突变是预先设定好的，所以也有人将该法称为“反遗传法”。