同源重组构建载体需要注意什么

问题描述

精选答案

1、DNA 连接酶用量与 DNA 片段的性质有关，连接平齐末端，必须加大酶量，一般使用连接粘性末端酶量的 10-100 倍。

2、在连接带有粘性末端的 DNA 片段时，DNA 浓度一般为 2-10mg/ml，在连接平齐末端时，需加入 DNA 浓度至 100-200mg/ml。

3、连接反应后，反应液在 0℃储存数天，-80℃储存 2 个月，但是在-20℃冰冻保存将会降低转化效率。

4、粘性末端形成的氢键在低温下更加稳定，所以尽管 T4 DNA 连接酶的最适反应温度为 37℃，在连接粘性末端时，反应温度以 10-16℃为好，平齐末端则以 15-20℃为好。

5、在连接反应中，如不对载体分子进行去 5'磷酸基处理，便用过量的外源 DNA 片段（2-5 倍），这将有助于减少载体的自身环化，增加外源 DNA 和载体连接的机会。