pcr多聚酶链式反应的操作过程

问题描述

精选答案

标准的PCR操作程序是将各种所需反应成分分别加入PCR反应管中，然后根据具体的实验要求，设置一定的循环参数，进行循环扩增。具体如下：

(1) 向PCR反应管中依次加入

DNA模板 50～300ng (约为102～105拷贝DNA)

引物(3'→5'，5'→3')各 2μl 10μmol/L (终浓度为0.4μmol/L)

dNTP 2μl 5mmol/L (终浓度为0.2μmol/L)

10×PCR缓冲液 5μl 1/10体积 (终浓度为1×)

MgCl2 3μl 25mmol/L (终浓度为1.5mmol/L)

Taq DNA聚合酶 0.5μl (终浓度约1～5U/μl)

ddH2O 补到终体积为50μl，混匀后，离心15 s使反应成分沉于管底。

(2) 加入矿物油20～30μl（2～3滴），以避免反应液蒸发(有热盖的PCR仪可省此步骤)，然后将反应管置于95℃（变性）5min。

(3) PCR的循环程序一般为：94℃～96℃变性30s， 50℃～55℃退火30～60s，72℃延伸(1kb/1～2min)，循环25～30次。末次循环结束后，将反应管置于72℃温育5min，以确保充分延伸。