质粒提取的步骤

问题更新日期：2024-10-12 08:59:08

问题描述

精选答案

质粒的提取步骤

1. 取通过单克隆过夜培养的新鲜菌1.5-5ml到新EP管，6000-8000rpm离心1-2min，尽量去上清（看菌长的情况怎么样，一般会养多的，所以低速离心，多丢掉点上清乃至混有上清的菌体也没关系，浪费就浪费了）；

2. 取冰盒，放入加了适当浓度的RNase酶的P1 buffer，在收集的菌体沉淀中加入250μl的P1 buffer，并用移液枪打匀（低速其实就是为了方便三下就迅速打匀，高速离心有轻微伤害，且打匀稍微费点劲而已）；

3. 再加入250μl的P2 buffer，温和地上下颠倒5-10次混匀，会有黏液状出现（像果冻一样，注意不要剧烈震荡混匀，有损伤，且可能导致基因组DNA断裂污染质粒，完全可以不静置，裂解时间长了有损伤）；

4. 迅速加入350μl的P3 buffer，再轻柔地上下颠倒5-10次混匀（迅速加P3和速度不要太快的混匀不冲突，剧烈震荡有损伤）；

5. 有白色絮状或块状出现，12000rpm离心5-10min（这里可以高速一下，免得吸取上清把蛋白等吸进去了，所以，吸取干净的上清就行，和之前一样，浪费了一些就浪费了，不要执着全吸走，我们要质量高的质粒，而不是要多的质粒）；

6. 转移全部上清液到吸附柱，4000-6000rpm离心30s-1min，弃废液（这里最好低速离心，充分让吸附柱吸附，所以看吸附柱情况调整转速和时间）；

7. 加入500μl pH=7.5的washing buffer至吸附柱中，4000-6000rpm离心30s-1min，弃废液（同上，低速慢慢洗）；

8. 重复7步骤再洗两次，如果要去除盐类，可以停留1-2min再离心（加洗液）；

9. 空柱12000rpm离心3-5min（这里一定要高速离心，去掉吸附柱里的残留液体，主要是酒精）；

10. 转移吸附柱到1.5ml新EP管，常温或加热开盖放置15-30min，挥发干净剩余酒精（也别太高温或者时间太长，没酒精味道就行）；

11. 轻轻加入65℃，40-50μl左右预热的EB buffer或者ddH2O至吸附柱覆膜中央，静置2min，再12000rpm离心30s-1分钟，留清液（一般，我们用去离子水就好了。免得后续质谱什么还收到残留胍盐影响）；

用Nano drop 2000 测量DNA含量，符合要求则进行下一步的比如电泳验证，酶切等实验。

其他回答

考研干货铺

质粒提取是从细菌中分离出目的性质粒的过程。

以下是通常的质粒提取步骤：

1.采样：从细菌中提取样品并将其放在含有缓冲液的管中。

2.纯化：将样品离心，并使用特定的纯化方法来去除细胞壁和其他的细胞碎片。

3.洗涤：在纯化后，对样品进行洗涤，以去除任何残余的污染物。

4.溶解：将样品进行溶解，并用酶解剂破坏细胞膜，释放出质粒。

5.离心：使用离心机离心样品，使溶解的质粒形成团块。

6.过滤：将团块通过滤纸进行过滤以去除残留的杂质。

质粒提取过程强调无菌操作，从而保证提取的质粒的纯度和完整度。

其他回答

小初的初中学习

1. 质粒提取的步骤一般包括细胞破解，离心纯化，质粒纯化等过程。

2. 在细胞破解过程中，一般采用化学法或机械破碎法破解细胞膜，使内部的质粒流出。

3. 离心纯化指的是采用离心机对混合液进行分离，将留存的质粒与细胞碎片分离开来。

4. 在质粒纯化过程中，需要通过柱层析、电泳等方法对纯化后的质粒进行进一步分离，得到纯净的质粒DNA。

其他回答

考研干货铺

质粒提取有三个基本步骤。第一步是细胞破裂，将要提取的质粒从细胞中释放出来。通常使用物理或化学方法进行破裂，例如超声波破裂或溶液中的化学试剂。第二步是进行质粒的分离。可以通过离心将质粒从细胞的碎片中分离出来，也可以利用化学手段，如硫酸钠沉淀法。第三步是纯化和浓缩，通过离心或柱层析技术来纯化质粒，也可以最后通过乙醇沉淀来浓缩质粒溶液。在实验中，质粒提取是基础而重要的实验步骤，需要注意设备的清洁和消毒，以保证实验的精确度和重复性。