TUNEL检测的实验方法

问题描述

精选答案

1. 充分脱蜡和水化。

脱蜡可以先60度20 min，再用二甲苯两次5~10 min；而水化用梯度乙醇从高浓度到低浓度浸洗，这些以便后面的结合反应充分、均匀。

2. 把握好细胞通透的时间。

一般根据切片的厚薄，选择蛋白酶k的孵育时间，常用10~30 min，几um切片用短时间；几十um切片用长时间，通过摸索达到既不脱片，有能够使后面的酶和抗体进入胞内。

3. 适当延长TUNEL反应液的时间。

一般是37度1h，你也可以根据你的凋亡损伤程度，选择更长的时间，可长至2 h，但要结合你最终的背景着色。

4. DAB显色条件的选择。

一般DAB反应10分钟左右，结合镜下控制背景颜色，最长不超过30 min；我不喜欢用promega公司提供的DAB液（桃红色），不利于辨认棕褐色。

5.PBS的充分清洗。

我个人认为，在TUNEL反应后和酶标反应后的清洗应十分严格，可增加次数达5次，因为这些清洗直接决定最后切片的非特异性着色。

6. 此外，内源性POD的封闭也十分关键。

对于肝脏、肾脏等血细胞含量多的组织，我的经验是适当延长封闭时间和升高过氧化氢的浓度，可以达到很好的封闭效果，且不影响最终的特异性染色。南昌中洪博元技术部