双缩脲试剂检验蛋白质的原理和条件

问题描述

精选答案

双缩脲法

用于鉴定蛋白质的分析方法

双缩脲法是一个用于鉴定蛋白质的分析方法。双缩脲试剂是一个碱性的含铜试液，呈蓝色，由1%氢氧化钾、几滴1%硫酸铜和酒石酸钾钠配制。当底物中含有肽键时（多肽），试液中的铜与多肽配位，配合物呈紫色。可通过比色法分析浓度，在紫外可见光谱中的波长为540nm。鉴定反应的灵敏度为5-160mg/ml。鉴定反应蛋白质单位1-10mg。

基本信息

中文名

双缩脲法

外文名

Biuret method

成分

氢氧化钾、硫酸铜、酒石酸钾钠

名词解释

双缩脲反应产生的紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关，故可用来测定蛋白质含量。

双缩脲试剂中真正起作用的是硫酸铜，而氢氧化钾仅仅是为了提供碱性环境，因此它可被其他碱，如氢氧化钠所代替。向试剂中加入碘化钾，可延长试剂的使用寿命。

基本概况

实验原理

双缩脲（NH2CONHCONH2）是两个分子脲经180℃左右加热，放出一个分子氨后得到的产物。在强碱性溶液中，双缩脲与二价铜离子形成紫色络合物，称为双缩脲反应。凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键，或能够以一个中间碳原子相连的肽键，这类化合物都有双缩脲反应。

紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关，故可用来测定蛋白质含量。干扰这一测定的物质主要有：硫酸铵、Tris缓冲液和某些氨基酸等。

此法的优点是较快速，不同的蛋白质产生颜色的深浅相近，以及干扰物质少。主要的缺点是灵敏度差，不适合微量蛋白的测定。

试剂与器材

1. 试剂：

1.

1. 试剂：

（1）标准蛋白质溶液：用标准的结晶牛血清清蛋白（BSA）或标准酪蛋白，配制成10mg/ml的标准蛋白溶液，可用BSA浓度1mg/ml的A280为0.66来校正其纯度。如有需要，标准蛋白质还可预先用微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量，计算出其纯度，再根据其纯度，称量配制成标准蛋白质溶液。牛血清清蛋白用H2O 或0.9%NaCl配制，酪蛋白用0．05N NaOH配制。

（2）双缩脲试剂：称以1.50克硫酸铜（CuSO4·5H2O）和6.0克酒石酸钾钠（KNaC4H4O6·4H2O），用500毫升水溶解，在搅拌下加入300毫升10% NaOH溶液，用水稀释到1升，贮存于塑料瓶中（或内壁涂以石蜡的瓶中）。此试剂可长期保存。若贮存瓶中有黑色沉淀出现，则需要重新配制。

2. 器材：

1.

2. 器材：

可见光分光光度计、大试管15支、旋涡混合器等。

操作方法

1.

标准曲线的测定：取12支试管分两组，分别加入0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0毫升的标准蛋白质溶液，用水补足到1毫升，然后加入4毫升双缩脲试剂。充分摇匀后，在室温（20~25℃）下放置30分钟，于540nm处进行比色测定。用未加蛋白质溶液的第一支试管作为空白对照液。取两组测定的平均值，以蛋白质的含量为横坐标，光吸收值为纵坐标绘制标准曲线。

2、样品的测定：取2~3个试管，用上述同样的方法，测定未知样品的蛋白质浓度。注意样品浓度不要超过10mg/ml。

其他回答

王律唠证券

蛋白质的肽键与双缩尿类似，可与铜离子在碱性环境下(双缩尿试剂)生成紫色络合物.稀氢氧化铜溶液(斐林试剂)有弱氧化性可与还原性糖中的醛基发生反应，生成砖红色的氧化亚铜沉淀。

双缩脲试剂是一种用于鉴定蛋白质的分析化学试剂。它是一种碱性的含铜试液，呈蓝色，由0.1 g/mL氢氧化钠或氢氧化钾、0.01 g/mL硫酸铜和酒石酸钾钠配制而成。

其他回答

一位电子工程师

双缩脲试剂可以用于检测待测样品中蛋白质的含量。配置好的双缩脲试剂和样本进行反应时，不需要什么特别的条件。

双缩脲试剂检测蛋白含量的原理是，蛋白质中的肽键可以在碱性环境下与铜离子发生反应，反应生成的络合物呈紫色。使用分光光度计，对反应后的颜色进行鉴定，与标准品进行比对，就可以得出蛋白质的浓度。

其他回答

优秀教师之家

脲(尿素)NH2-CO-NH2加热至150~160 °C时,两分子缩合成双缩脲。双缩脲能和硫酸铜的碱性溶液生成紫色络和物,这种反应叫双缩脲反应。(缩二脲反应)蛋白质分子中含有肽键“–CO-NH-”与双缩脲结构相似。

在同样条件下也有呈色反应,在一定条件下,其颜色深浅与蛋白质含量成正比,可用分光光度计来测其吸光度,确定含量。(560 nm)。

其他回答

消防员健康

原理是CuSO4在碱性条件下与具有两个肽键以上化合物反应生成络合物，显紫色。不需要加热进行。注意双缩脲试剂和斐林试剂的区别。