制作测序报告需要注意什么

问题描述

精选答案

制作测序报告要注意，1. 测序所用模板DNA的量一般按下表要求加入：由于超螺旋质粒产生的信号比松驰的线性双链DNA弱，因此使用超螺旋质粒作为模板时其用量要比其它模板大一些。

模板种类/长度 模板量

200 bp（PCR产物） 16 ng（120 fmol）

3000-5000 bp（超螺旋质粒DNA） 4 mg（2 pmol）

48 000 bp（λ粘粒DNA） 1 mg（31 fmol）

2. 计算与4.5 pmol 相当的引物纳克数可用以下一般公式：

4.5 pmol=1.5 ng×n，其中n为引物碱基数

计算与1 pmol 相当的引物微克数可用以下一般公式：

dsDNA：1 pmol=（6.6×10-4 mg）×n，其中n为模板碱基对数

ssDNA：1 pmol=（3.3×10-4 mg）×n，其中n为模板碱基数

3. 为阻止TaqDNA聚合酶延伸非特异性退火引物，热循环仪必须预热至95℃。温度变换应越快越好。下面的循环时间不包括变温时间。如果你无法确定使用何种模式，建议从模式1开始。

模式1：适用于引物<24碱基或GC含量<50%

95℃2分钟。然后：95℃30秒（变性），42℃30秒（退火），70℃1分钟（延伸）。

模式2：适用于≥24碱基或略短的GC含量≥50%的引物。

95℃2分钟。然后：95℃30秒（变性），70℃30秒（退火/延伸）。

4. 在加入终止溶液之后样品可在4℃保存过夜。

5. 水的质量对于染色的成功极其重要。超纯水（NANOpureR或Milli-QR的水）或双蒸水可获得较好的效果，如果水中有杂质，则低分子量条带可能无法出现。

6. 碳酸钠也非常重要。使用新鲜的，美国化学学会级碳酸钠较好，如Fisher和KodakACS试剂级碳酸钠，一般可获得较好的结果。