tunnel染色方法

问题描述

精选答案

1.常规方法制作石蜡切片，用二甲苯浸洗2次，每次5min;

2.用梯度乙醇(100、95、90、80、70%)各浸洗1次，每次3min;

3.PBS漂洗2次用ProteinaseK工作液(20ug/ml)处理组织15-30min在21-37°C(温度、时间、浓度均需摸索)或者加细胞通透液8min;

4.加入含2%过氧化氙的PBS，室温反应5min，PBS漂洗2次

5.制备TUNEL反应混合液，处理组用50ulTdT450ul荧光素标计的dUTP液混匀:而阴性对照

组仅加50ul荧光素标记的dUTP液，阳性对照组先加入100ulDNase1，反应在15~25℃x10min，后面步骤同处理组。

6,玻片干后，用滤纸小心吸去切片周围多余液体，加50ulTUNEL反应混合液(阴性对照组仅加50ul荧光素标记的dUTP液)于标本上，加盖玻片或封口膜在暗湿盒中反应37℃*1h。

7.加入到已预热37℃的洗涤与终止反应缓冲液，37℃保温30min，PBS漂洗3次;

8,可以加1滴PBS在荧光昂微镜下计数凋广细胞(激发光波长为450~500nm，检测波长头

515~565nm);

9.玻片干后加50ulDIG-POD干标本上，加盖玻片或封口膜在暗漏盒中反应37℃*30min.

10.PBS漂洗3次:在组织外加50~100uIDAB底物，反应15~25C*10min:

11.PBS漂洗3次:拍照后再用苏木素或甲基绿复染，几秒后立即用自来水冲洗。梯度酒精脱水、二甲苯透明、中性树胶封片。

12.加一滴PBS或甘油在视野下，用光学易微镜观察凋亡细胞(共计200~500个细胞)并拍照。

其他回答

观消防

Tunnel staining法是一种染色方法，它可以用于显示核仁的细胞结构。它的工作原理是将核仁的蛋白质染色，然后将其固定在样本上，再将其通过电子显微镜观察，从而获得核仁细胞结构的详细图像。

其他回答

会计伯伯

tunnel 的凋亡染色并不是专门去染细胞核，但它可以使细胞核着色。 TUNEL全名为terminal -deoxynucleotidyl transferase mediated nick end labeling汉语为：脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法。原理：细胞凋亡中, 染色体DNA双链断裂或单链断裂而产生大量的粘性3’末端，可在脱氧核糖核苷酸末端转移酶(TdT)的作用下，将脱氧核糖核苷酸和荧光素、过氧化物酶、碱性磷酸酶或生物素形成的衍生物标记到DNA的3’末端，从而可进行凋亡细胞的检测。

由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有DNA的断裂，因而没有3’末端形成，很少能够被染色。

TUNEL实际上是分子生物学与形态学相结合的研究方法，对完整的单个凋亡细胞核或凋亡小体进行原位染色，能准确地反应细胞凋亡典型的生物化学和形态特征，可用于石蜡包埋组织切片、冰冻组织切片、培养的细胞和从组织中分离的细胞的细胞形态测定，并可检测出极少量的凋亡细胞，因而在细胞凋亡的研究中被广泛采用.