实时荧光定量PCR可以用来精确测定DNA浓度吗

问题描述

精选答案

实时荧光定量PCR不是用来测浓度的，可以用来做基因的拷贝数。但是如果你的产物单一，有相应的标准品，也是可以测浓度的，浓度的准确性和你的标准曲线相关。

实时荧光定量PCR：

实时荧光定量PCR( realtime fluorescence quantitative PCR，RTFQ PCR) 是1996 年由美国Applied Biosystems 公司推出的一种新定量试验技术，它是通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针，对PCR产物进行标记跟踪，实时在线监控反应过程，结合相应的软件可以对产物进行分析，计算待测样品模板的初始浓度。检测指标是：各样品的目的基因和管家基因分别进行Realtime PCR反应。PCR产物与 DNA Ladder在2%琼脂糖凝胶电泳，GoldView染色，检测PCR产物是否为单一特异性扩增条带。

精确测定DNA浓度的方法：

DNA纯度和浓度的检测:分光光度(紫外吸收)法1.预热紫外分光光度计10-20分钟。

2. 取所需的比色杯（4ml），其中一只装入3 mlH2O溶液，作为空白液，用来校正分光光度计零点及调整透光度至100。

3. DNA纯度及浓度的测定：

①取3微升的DNA样品加入比色杯，加dH2O至3000微升，混匀。

②将比色杯置入分光光度计中，调入射光波长，分别用空白溶液调整零点（T为100，OD为0），测待测样品在260nm、280nm、230nm的OD值。

③计算浓度：DNA浓度（ug/ml）=A260×50ug/ml×稀释倍数对于双链DNA 1.0 OD260=50 ug/ml对于单链RNA 1.0 OD260=40 ug/ml4. 纯的DNA溶液其OD260/OD280应为1.8，OD260/OD230应大于2.0。⑴ OD260/OD280大于1.9时，说明有RNA污染，小于1.6时表明有蛋白质或酚污染。