引物与产物的退火温度差别较大有哪些影响

问题描述

精选答案

预变性

模板DNA完全变性与PCR酶的完全激活对PCR能否成功至关重要,一般未修饰的Taq酶激活时间为两分钟.

变性步骤

循环中一般95℃,30秒足以使各种靶DNA序列完全变性,可能的情况下可 缩短该步骤时间

变性时间过长损害酶活性,过短靶序列变性不彻底,易造成扩增失败.

引物退火

退火温度需要从多方面去决定,一般根据引物的Tm值为参考,根据扩增的长度适当下调作为退火温度.然后在此次实验基础上做出预估.

引物延伸

引物延伸一般在72℃进行（Taq酶最适温度）.

循环数

大多数PCR含25-35循环.

最后延伸

在最后一个循环后,反应在72℃维持10-30分钟．使引物延伸完全,并使单链产物退火成双链.