蔗糖酶纯化的方法

问题描述

精选答案

1. 提取

A称取60g干酵母粉置500ml的烧杯中，加90ml水，在室温下自然发酵过夜或放37℃培养箱发酵起泡。

B准备一个冰浴，将研钵稳妥放入冰浴中。

C称取10g湿润的酵母和少数的石英砂（5g以下，且要预先研细）置研钵中。

D在酵母中缓慢的加入预冷的去离子水15ml，，边加边研磨，约30分钟至酵母细胞大部分被研碎。

E混合物转入离心管中，平衡后用高速冷冻离心机离心，10000r/m离心15min。

F滴管小心地取出水相，转入一个清洁的离心管中，4℃10000r/m，离心15min。

G量出上清液体积，留取1.5ml测定酶活力及蛋白含量。剩余部分转入清洁烧杯中用1mol/L乙酸将pH调至5.0，称为“粗级分Ⅰ”。

2. 热处理

A将盛有粗级分Ⅰ的离心管稳妥地放入50℃水浴中保温30min，在保温过程中不断轻摇离心管。

B到达30min后，置冰浴中迅速冷却，用10000r/m，离心15min。

C量出上清液体积，留出1.5ml测定酶活力及蛋白质含量（称为“热级分Ⅱ”）。

3. 乙醇沉淀

A将热级分Ⅱ转入小烧杯中，放入冰盐浴（没有水的碎冰撒入少量食盐），逐滴加入等体积预冷至-20℃的95％乙醇，同时轻轻搅拌30min。再在冰盐浴中放置10min，以沉淀完全。

B于4℃ 10000r 离心10min，弃上清，并滴干，沉淀保存于离心管中，盖上盖子或薄膜封口，然后将其放入冰箱中冷冻保存（称为“醇级分Ⅲ”）。