那位高手知道SDS-PAGE梯度胶怎么配置

问题描述

精选答案

操作步骤（ 1 ）在制板支架上置一专用有机玻璃槽，将固定好的玻璃板下部插入槽内，中部用两个文具夹固定在支架竖板上。在槽内倒入已充分溶化的琼脂，冷凝后封闭胶腔底部。（ 2 ）用直径约 2mm 的聚乙烯管连接好梯度混合器、恒流泵、凝胶模。（ 3 ） 30% 胶液的配制取 50ml 烧杯一只，加凝胶贮液① 14ml ，水 14ml, 10 过硫酸铵 5 μ l ，减压抽气 10min 。（ 4 ） 4% 胶液的配制 取 50ml 烧杯一只，加凝胶贮液② 14ml ，水 14ml, 10% 过硫酸铵 5 μ l ，减压抽气 10min 。（ 5 ）灌制梯度胶在两胶液中分别加入 TEMED 15 μ l ，摇匀，分别吸取 18ml 胶液于梯度混合器相应的混合杯中。打开磁力搅拌器和梯度混合器开关，接通恒流泵，将梯度混合器中的胶液缓缓输入胶腔中。事先应将输液管出口由胶腔上口中央伸向底部，随着胶腔内液面的升高逐渐提高输液管，使管口始终接近液面而不伸入液体内部。灌胶的流速要适当，以管口流出液对液面不形成冲击为好。（ 6 ）灌胶完毕后，在液面上小心地加入 25 ％乙醇约 0 . 5 cm 封闭胶面。静置半小时左右即可聚合。（ 7 ）待凝胶聚合后，倒掉乙醇溶液，用滤纸条吸干上层残留液，吸取 5 ml 4% 胶液，加入 5ulTEMED ，于烧杯中轻轻摇匀，加到梯度胶上，迅速插入样品梳，样品梳下沿刚好触及梯度胶面为宜，静置聚合。（ 8 ）凝胶聚合后，拔掉样品梳，装好电泳槽，在上下槽中注入一电极缓冲液。（ 9 ）待测样品的制备同标准蛋白质，制备好的样品用微量注射器点样，每样品槽点样 25 一 50 μ l 。（ 10 ）上槽为负极，下槽为正极，连接好电泳仪，用恒压（ l00V 左右）或恒流 (20mA 左右）电泳。当指示剂跑出胶片后，将电压升高至 150V ，继续电泳 15h 左右。（ 11 ）剥胶后用蒸馏水洗涤胶片，然后浸入染色液中 4--5 h 或过夜。取出后用自来水稍加洗涤，置于脱色液中振荡脱色，中途更换脱色液数次，直至背景清晰为止。