ti质粒怎么导入农杆菌

问题描述

精选答案

转化：目的基因插入Ti质粒的T-DNA上——进入农杆菌——导入植物细胞——目的基因整合到植物染色体的DNA上——目的基因得以稳定维持和表达

1、获取目的基因：用限制性核酸内切酶切割下目的基因。

2、基因表达载体的构建：将目的基因与载体（大多数选用质粒）用DNA连接酶连接起来。

3、将目的基因导入受体细胞：将含目的基因的重组质粒导入农杆菌（农杆菌为受体细胞）。

4、目的基因的检测与鉴定：用DNA分子杂交技术/分子杂交技术/抗原-抗体杂交/个体生物学水平鉴定（这个方法需要导入重组后的细胞的植物体，详见第五步） 几种方法进行检验（根据要求选取不同方法）。

5、最后将成功表达的细胞导入植物体内，对植物体进行个体生物学水平鉴定。

整个转基因体系的建立步骤大致可以归纳为：目的载体的构建---载体的农杆菌转化---农杆菌与植株共培养---转化植株的筛选---转化植株的鉴定。

在每一步中都涉及到很多的方法与技术。目的载体的构建，包括目的基因的克隆、载体的酶切、连接(用限制性核酸内切酶与DNA连接酶），以及测序分析。载体的农杆菌转化，目前有很成熟的方法，试验中应注意热激和冷激的时间。农杆菌与植株的共培养，即为植株转化实验，在溶液中加入促进植株愈伤生长的激素能一定程度提高转化率。转化植株的筛选，大多是利用抗生素进行筛选的，抗生素的选择则需根据目的载体确定，设置不同梯度的抗生素对植株进行筛选。转化植株的鉴定，一般采用PCR法。以上所有的操作，都应该在无菌环境下进行，无菌是植物组培的一项基本，但是重要的要素。