DNA的碱基链是如何通过化学方法合成的

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精选答案

我们采用固相亚磷酰胺三酯法合成 DNA 片段，它 具有高效、快速的偶联以及起始反应物稳定的特点。亚磷酰胺三酯法是将 DNA 固定在固相载体上完成 DNA 链的合成的，合成的方向是由待合成引物的 3' 端向 5' 端合成的，相邻的核苷酸通过 3' → 5' 磷酸二酯键连接，具体反应步骤如下： 第一步：将预先连接在固相载体 CPG 上的活性基团被保护的核苷酸与三氯乙酸反应，脱去其 5'- 羟基的保护基团 DMT ，获得游离的 5'- 羟基。 第二步：亚磷酰胺保护的核苷酸单体，与活化剂四氮唑混合，得到核苷亚磷酸活化中间体，它的 3' 端被活化，与 CPG 载体上连接碱基的 5'- 羟基发生缩合反应。 第三步：带帽 (capping) 反应，缩合反应中会有少量 5'- 羟基没有参加反应，用乙酸酐和 1- 甲基咪唑封闭 5'- 羟基，使其不能再继续发生反应，这种短片段在纯化时可以分离去除。 第四步：在氧化剂碘的作用下，亚磷酰形式转变为更稳定的磷酸三酯。 经过以上四个步骤，一个脱氧核苷酸被连接到固相载体的核苷酸上。再以三氯乙酸脱去它的 5'- 羟基上的保护基团 DMT ，重复以上步骤，直到所有要求合成的碱基被接上去。