qpcr 退火温度

问题描述

精选答案

1、退火温度低于引物Tm值5 ℃左右，一般在45～55℃。退火温度需要从多方面去决定，一般根据引物的Tm值（Tm值=4(G+C) +2(A+T)）为参考，根据扩增的长度适当下调作为退火温度。然后在此次实验基础上做出预估。退火温度对PCR的特异性有较大影响。

2、延伸时间：1min/kb(10kb内）。引物延伸一般在72℃进行（Taq酶最适温度）。但在扩增长度较短且退火温度较高时，本步骤可省略延伸时间随扩增片段长短而定，一般推荐在1000bp以上，含Pfu及其衍生物的衍生设定为1min/kbp。扩展资料PCR的过程：

1、DNA变性：（90℃-96℃）：双链DNA模板在热作用下，氢键断裂，形成单链DNA2、退火：（60℃-65℃）：系统温度降低，引物与DNA模板结合，形成局部双链。

3、延伸：（70℃-75℃）：在Taq酶（在72℃左右，活性最佳）的作用下，以dNTP为原料，从引物的3′端开始以从5′→3′端的方向延伸，合成与模板互补的DNA链。