PCR产物纯化之后，直接连接T载体什么原因导致总是连不上

问题描述

精选答案

很明显目的片段没有插入成功，但仍然长出菌落的这个现象可能由于以下原因：

1、抗性失效了

2、插入的片段不够纯

3、有杂菌或被实验室里其他含有抗性的大肠杆菌污染了

解决方式可以从以下几个方面考虑：

用的什么抗生素？

长出来菌落的数量多么？如果插入片段浓度不大却长出大量菌落，那可能是污染或者抗生素失效了

测序结果是怎么样的？可以blast一下测序结果看看插入跟你的目的片段的差异情况。

插入片段是多大的？纯化过吗？

连接酶可能失效了。

载体自连了，检查一下酶切位点对不对。

其实，做一个阴性和阳性对照就能大概找到原因。

我两年多没做实验了，可能回答不对，仅供参考。慢慢来，你会找到原因的，祝实验顺利。